抗生素耐药性是威胁全球公众健康的重要隐患，然而新型抗菌药物的研发却异常缓慢。此外，目前临床上细菌感染的诊断多局限于组织活检和微生物、生化分析，繁琐费时，且灵敏度低。尽管67Ga-枸橼酸、18F-脱氧葡萄糖、以及放射性核素标记的白细胞等影像探针的陆续问世，极大地改善了临床细菌感染的诊断现状，但它们均无法特异性识别细菌感染，导致误诊和误治不断出现。面对“超级细菌”的迅速蔓延，“后抗生素时代”的步步逼近，寻找新型且不易诱发耐药性的细菌感染诊疗手段，是这场人类与细菌博弈战中亟待解决的难题。
BeyondAntibiotics
hoto/SonodynamicApproachesforBacterialTheranosticsXinPang*,DengfengLi,JingZhu,JingliangCheng*,GangLiu*NanoMicroLett.()12
p>本文亮点
1.本文综述了光/声动力策略在细菌感染诊断和治疗方面的最新研究进展。
2.光/声敏剂的内在光学特性可有效实现细菌感染的影像诊断。
3.活性氧分子作为光/声动力策略的效应器，具有高广谱杀菌活性，且不受抗性困扰。
内容简介
厦门大学刘刚教授及医院庞鑫博士等在本综述中系统地总结了光/声动力策略的机制、抗菌靶点、以及在细菌感染诊疗中的应用。
其中，根据光敏剂的光学性能和结构特点，将光动力策略分为三大类论述：1)聚集引发淬灭型光敏剂；2)聚集诱导发光型光敏剂；3)纳米光敏剂。
声动力策略则以三种常用的增效手段进行分类论述：1)细菌特异性的纳米系统；2)联合疗法；3)产氧纳米酶。
最后，本文讨论了现有光/声动力策略的潜在限制，展望了其在细菌感染诊断和治疗领域的发展方向。
图文导读
I光/声动力策略的作用机制
光动力疗法是一种新型抗菌手段，主要利用光照激活光敏感物质(即光敏剂)，促使其产生活性氧分子(ROS)以杀伤细菌。目前，光动力疗法的作用机制较为明确：光敏剂分子在接受激发光辐照后吸收光子，从稳定的基态(S0)跃迁为不稳定的激发态(S1)；随后通过系统间交差作用，转变成较为稳定的三重态(T1)。在此过程中，多余的能量会以发射荧光的形式释放，从而用于临床显影和光检测。三重态的光敏剂可触发两种光化学反应(图1)。TypeI机制下，T1光敏剂分子将自身的电子或氢原子转移给周围的氧分子，以产生含氧自由基，如超氧阴离子(O2)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)；TypeII机制下，T1光敏剂分子直接将能量转移至外周基质中的三线态氧分子(3O2)，使其转化为单线态氧(1O2)。这两种机制不完全独立，常同时发生。声动力疗法起源于光动力疗法，它主要利用低频超声波来激发敏感剂以产生ROS。目前声动力治疗的机制尚未定论，但是有两种主流观点，即声致发光和热解作用。声致发光是指超声波对机体内液体爆破产生气泡，在气泡涨大破裂时产生光，以作用于声敏剂，使其转化为激发态；热解作用则指利用声动力过程中的局部高温、高压来激活声敏剂。无论是哪种机制，目前公认ROS为声动力疗法的主要效应器。图1.光动力策略的抗菌机制。
II光/声动力策略的抗菌靶点
根据革兰氏染色法，细菌可分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两种类型。革兰氏阴性菌的结构含有较厚的脂多糖外层，极大地阻碍了敏感剂入胞发挥作用。相反，革兰氏阳性菌不但没有脂多糖层，其肽聚糖层还呈现孔洞结构，有利于敏感剂的进入，因此对光/声动力策略也更为敏感。作为光/声动力策略的主要效应器，ROS的半衰期极短、运动半径有限。因此敏感剂只有进入细菌胞内，或至少与细菌表面贴合，才能获取最大的抗菌效果。而细菌表面的呈电负性，也使得阳离子型的敏感剂更易于与细菌结合并内在化。通常来讲，ROS抗菌的主要靶点为菌膜磷脂、功能性蛋白、以及核酸。它通过破坏细菌的膜磷脂和膜蛋白，以破坏细菌结构的完整性，引发细菌胞内物质的泄漏，或诱导膜转运系统和相关蛋白酶的功能失活。此外ROS还能不可逆地损伤细菌DNA中的碱基和糖组分，进而破坏DNA的双链结构，干扰细菌的正常增殖和生理代谢。ROS对细菌形态和功能的破坏通常同时发生，并最终抑制细菌生长，甚至使其死亡。III基于光动力策略的细菌诊疗3.1聚集引发淬灭型光敏剂
聚集引发淬灭(ACQ)型光敏剂是一类传统的小分子光敏剂。它们大多具有刚性结构，分散于溶液后，随着浓度的升高而聚集，导致自身荧光发射逐渐衰弱。ACQ型光敏剂多见于卟啉及其衍生物、酞菁类、吩噻嗪类等化学物质。其中以卟啉结构研究最为广泛。为了改善光敏剂的水溶性，提高其对细菌的靶向性，近年来一系列两亲性的卟啉偶联物被研发。例如，利用胆固醇对细菌菌膜的高度亲和性，将原卟啉IX与胆固醇化学偶联后，可有效用于细菌的荧光标记，并对革兰氏阳性菌和阴性菌均显示了良好的光动力致死性(图2a)。此外，利用两类革兰氏细菌结构的不同，脂多糖亲和肽-原卟啉IX偶联物能够特异性结合革兰氏阴性菌的脂多糖层，对其荧光显影和光致死；而聚精氨酸修饰的卟啉偶联物则能选择性地插入革兰氏阳性菌的多孔肽聚糖层，相较于阴性菌显示更强的光声信号和光动力抗菌活性(图2b)。由于卟啉类光敏剂大多只有单一波长的发射光，其光学成像效果极易受浓度影响，降低了疾病诊断的敏感性和准确性。为了实现多发射波长的影像诊断，有研究者以荧光硅纳米粒为载体，并对其表面修饰葡聚糖，以借由ATP结合盒转运通路靶向细菌(图2c)。装载光敏剂二氢卟吩e6后，该纳米粒在nm的光照射下，能同时发射nm和nm的荧光。该双发射荧光成像模式可高效追踪细菌感染，活体感染检测限低至菌落形成单位。激光照射下(nm,12mWcm2,40min)，纳米体系对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的光动力抗菌效率分别高达98%和96%。
除了卟啉类ACQ型光敏剂，酞菁类光敏剂的代表硅酞菁、亚酞菁，吩噻嗪类光敏剂的代表甲基蓝，以及香豆素、吲哚菁绿等光敏剂也在细菌感染的光学诊断和光动力治疗领域显示出巨大的潜力。尽管ACQ型光敏剂品类繁多，但是真正进入临床，为人类健康服务的仍是少数。在光敏剂的设计过程中，有以下几点需着重考虑：1)良好的水溶性；2)光吸收位于近红外区域；3)低暗毒性和皮肤光毒性；4)高量子产率；5)在细菌感染区域特异性富集，在正常组织中快速清除。
图2.基于卟啉光敏剂的细菌诊疗。
3.2聚集诱导发光型光敏剂
聚集诱导发光(AIE)型光敏剂是一类新兴的小分子光敏剂。有别于ACQ型光敏剂，AIE型光敏剂在溶解状态下无荧光发射，而在聚集状态下呈现强烈的荧光发射信号，并显示光动力活性。这一独特的光学性能促使该类光敏剂具有良好的光稳定性，无自淬灭困扰；在影像诊断过程中表现出高信噪比、低检测限等优势。尽管如此，AIE型光敏剂也不可避免的存在一些缺陷，如ROS产率低和细菌靶向性差。研究显示，向AIE分子中引入电子供体和电子受体结构，可有效拓宽其光吸收，提高其摩尔吸光系数，从而增强光敏剂的ROS产率。而AIE光敏剂的细菌靶向诊疗则可通过以下手段实现：1)对AIE分子修饰细菌靶向因子，如阳离子基团、多肽、单克隆抗体等；2)引入噬菌体；3)代谢性生物分子标记。
在胞内菌感染领域，AIE型光敏剂也独具优势。细胞内病原体感染是临床抗感染治疗面临的严峻挑战。目前，临床上抗胞内菌感染治疗的常用策略是长期使用高剂量抗菌药物，极易引发不良反应，诱导细菌耐药性产生。有研究显示，用细菌代谢性前体D-丙氨酸修饰AIE光敏剂后，可有效用于胞内菌感染的光学可视化和在体消融(图3a)。经细胞代谢，该修饰物(TPEPy-D-Ala)插入细菌的肽聚糖，AIE分子在细菌表面发生聚集，触发荧光发射，以点亮细菌(图3b)。进一步光照射后，TPEPy-D-Ala高效产生单线态氧，最小抑菌浓度为20±0.5μg/mL，远低于临床常用的抗菌药万古霉素(μg/mL)。此外，半胱天冬酶-1敏感肽偶联的AIE光敏剂，也可用于胞内菌的诊断和光治疗(图3c)。被巨噬细胞摄取后，该偶联物(PyTPE-CRP)被吞噬体中高表达的半胱天冬酶-1裂解，释放AIE光敏剂。在胞内的亲水环境下，疏水性的AIE分子发生自聚集，激活荧光成像和光动力抗菌性能(图3d)。由于ROS极短的半衰期和细菌特异性的酶响应活性，PyTPE-CRP偶联物有望在高效抗菌的同时而不损伤巨噬细胞(图3e,f)。
图3.AIE型光敏剂在胞内菌感染诊疗中的应用。3.3纳米光敏剂近年来，纳米技术的蓬勃发展极大地改变了疾病诊疗理念。利用纳米技术制备而成的纳米级光敏剂，是一类本身就具有光敏特性的纳米粒，而非传统的小分子物质。它们通常无需额外的增溶剂便可分散在水中，为躲避机体防御系统和血循环的清除提供潜在条件。目前常见的纳米光敏剂主要有量子点、二氧化钛、介孔硅、富勒烯、金、钌、上转化纳米粒，以及二硫化钼和黑磷纳米片等。其中，金纳米粒和上转化纳米粒在细菌感染的诊疗领域十分有潜力。Sun等制备了上转化纳米纳米粒子(UCNPs)和蛋黄壳结构的金纳米粒子(AuYS)的异质二聚体，用于定量分析耐多粘菌素B型大肠杆菌。这种材料会产生圆二色性(CD)和上转换发光(UCL)两种信号。基于与UCNPs耦合的多粘菌素B的浓度，该体系可通过双信号有效检测细菌的多粘菌素B耐药水平。在nm激光照射下，纳米体系显示了良好的UCL成像性能，成功分辨多粘菌素B敏感菌株和耐药菌株所诱导的小鼠感染，并对其进行光动力治疗。这种新型的双模异质二聚体对耐药性细菌的监测和控制表现出了良好的应用价值。与ACQ和AIE型小分子光敏剂相比，纳米光敏剂显示了更好的可调谐性、生理稳定性和多功能性等。然而，值得注意的是，许多无机纳米光敏剂都具有剂量依赖性的毒副作用。重复用药时，存在蓄积毒性的风险。因此，研发具有良好安全性和高度可降解性的纳米光敏剂是未来的研究热点。图4.基于金纳米粒和上转化纳米粒的细菌感染诊疗。IV基于声动力策略的细菌诊疗相较于光动力技术而言，声动力利用超声作为激发手段，对机体组织具有良好的穿透深度，可以弥补光激发治疗所带来的不足。不同于光动力技术，声动力所用的激发源为20kHZ-3MHz的低频超声波，对软组织的穿透深度高达10cm，可有效作用于机体深部病灶。并且该波段范围内的超声波不会引发热效应，对病灶周围组织的副作用较小，可实现深部疾病高效、无创治疗，极大地解决了光动力技术的穿透深度瓶颈。但是声动力策略在临床转化和应用中，仍存在不足。声动力过程中，由于声波的能量利用效率相对较低，单一使用声动力疗法往往疗效不佳，难以及时且彻底的清除细菌感染。所幸，现阶段研究提出了以下几种解决方案。4.1细菌特异性纳米系统细菌感染具有较强的异质性和适应性，并与其他炎性疾病(如无菌性炎症和肿瘤)的微环境高度相似，呈现弱酸性，且具有明显的炎症细胞浸润等现象，加大了精准诊疗的难度。有别于临床探针靶向细菌微环境的策略，利用细菌与宿主细胞某些代谢通路的不同，研发基于细菌特异性代谢途径的靶向纳米系统，有望克服临床细菌感染诊疗的低特异性缺点，且避免了抗体、抗菌肽、抗生素等介导的特异性靶向探针成本高、稳定性差、易受耐药性影响的问题，为细菌感染的精准诊疗提供新思路。庞鑫博士等制备了麦芽六糖修饰的纳米脂质体，并用其装载声敏剂紫红素18(图5a)。在细菌特异性麦芽糖转运系统的帮助下，该纳米体系可靶向递送声敏剂至细菌感染部位，以实现细菌感染的近红外荧光、光声影像诊断；并能够精准区分细菌感染与无菌性炎症和肿瘤(图5b)。在磁共振成像技术的可视化监测下，该声动力介导的抗菌治疗彻底清除了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所诱导的脓性肌炎，实现了精确诊断、高效治疗、以及实时监测疗效为一体的声动力抗菌策略。图5.改良增效型声动力策略在细菌诊疗中的应用。4.2联合疗法将抗菌声动力疗法与其他治疗模式相联用，是一种近年来常用的高效抗菌策略。它能够增强细菌对声动力策略的敏感性，打破声动力治疗中存活细菌的细胞保护效应。在声动力过程中，超声波仅辐照疾病部位，而ROS又具有非特异性的作用机制和极低的致突变性。因此，基于声动力策略的联合疗法有效降低了重叠毒性，提高了疾病治疗的系统安全性，且不易诱导交差抗性的产生。由于目前常用的声敏剂大多来源于光敏剂，声动力策略被广泛与光动力策略相联合。Wang等人利用上转化材料包裹Fe3O4纳米粒，并在表面修饰血卟啉单甲醚(HMME)，制备了壳-核结构的多功能纳米平台。该纳米体系可通过Fe3O4的磁共振成像性能，诊断小鼠细菌感染。外加激光(1Wcm2,10min)和超声(2Wcm2,10min)刺激后，敏感剂HMME的光/声动力活性被有效激活，大量产生ROS，对超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀伤率高达%。本课题组提出了一种用于桥接抗菌声动力疗法和抗毒素免疫疗法的生物启发策略(图5c)。利用基因工程改造技术在细胞膜表面定向展示用来中和金黄色葡萄球菌α-毒素的抗体，并用此细胞膜形成纳米囊泡，进行声敏剂的包封。体内光学成像显示，抗体导向的纳米捕获器可以成功定位金黄色葡萄球菌感染部位，并准确地区分细菌感染病灶和无菌性炎症。超声刺激后(1MHz,0.97Wcm2,50%脉冲周期,8min)，该仿生纳米平台一方面可通过抗体-毒素相互作用精准的的捕获细菌所分泌的致命毒素，另一方面，高产的ROS可有效杀死病菌(图5d,e)。这种声动力/免疫联合疗法可彻底治愈耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的肌炎小鼠。虽然现有的改良增效型ROS声疗体系能较好地对抗耐药菌感染，但是依然面临着实际应答率低，制备繁琐、成本较高、操作复杂(如需同时外加光源和超声刺激)等问题。因而，研发更为廉价易得且简便的改良增效型声动力联合治疗体系意义重大。4.3产氧纳米酶在声动力过程中，ROS的产生高度依赖声敏剂周围的氧气浓度。而乏氧的细菌感染微环境极大地限制了ROS的产生，降低了声动力策略的抗菌活性。此外，声动力过程中快速的氧气消耗也进一步阻碍其治疗效果。因此研发具有产氧功能的纳米酶，改善乏氧微环境，可有效增敏声动力策略。而赋予纳米酶可控的刺激响应性，则能够在精准调控氧气产生的同时，降低酶促反应相关的潜在毒副作用。本课题组将PdPt纳米片与有机声敏剂(T)桥接，构建了一种超声响应的纳米酶系统(图5f)。声敏剂的修饰阻断了PdPt纳米片的过氧化氢酶活性；而在超声刺激下，该纳米酶活性迅速恢复，以催化内源性H2O2分解为O2，增敏声动力疗法(图5g,h)。在纳米酶系统的三模态(荧光、光声、CT)影像诊断指导下，小鼠细菌感染病灶被精准定位。外加超声后(1MHz,0.97Wcm2,50%脉冲周期,8min)，声敏剂被有效激活产生ROS的同时，纳米体系的也重获酶活性，以产氧增敏ROS高产，从而彻底清除小鼠耐药菌感染。这种酶活性的“开关”效应对于降低纳米酶在正常组织中的毒副作用，实现精准的、可控的、疾病位点特定的酶催化效应尤为重要。V展望由于敏感剂的内在光学特性和ROS的广谱抗菌活性，光/声动力策略在细菌的诊断和治疗领域极具优势，并取得了很大的进展，未来的潜在研究热点有：(1)优化现有光/声敏剂，研发新型光敏剂以高产ROS，尤其是高杀伤性的羟基自由基。(2)利用细菌特异性铁代谢途径(如铁载体)，实现光/声敏剂的高效胞内递送，有效逆转细菌耐药性。(3)放射性核素标记光/声敏剂，以整合临床核医学成像和放射疗法。
作者简介
庞鑫博士
本文第一通讯作者
医院
▍主要研究领域主要从事超声响应型诊疗一体化纳米探针构建及其在细菌感染中的应用研究。具体包括(1)基于生物启发策略的纳米声敏剂构建；(2)生物正交剪切反应在细菌感染诊疗中的应用；(3)改良增效型声动力疗法的探索。
▍主要研究成果
在AdvancedMaterials、AdvancedFunctionalMaterials、ACSNano、PharmacologyTherapeutics、JournalofControlledRelease等高影响力学术期刊以第一作者或通讯作者发表论文20余篇(IF10论文7篇)。所提出的“一箭双雕”声免疫抗菌策略被AdvancedScienceNews专题报道并获国家专利授权2项。▍Email:pangxin.
