621李振论文 [复制链接]

论文独创性声明

本人是在指导老师帮助指导下，本人单独进行实验研究和开发工作。所取得的成果皆为本人所属。除文中已特别加以注明引用的内容外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本声明的法律结果由本人承担。

特此声明。

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摘要

酪氨酸酶又称多酚氧化酶或儿茶酚氧化酶具有重要的生化特性,广泛的存在微生物、动、植物体中。酪氨酸酶在医药制备、有机合成、精细化工等领域具有广泛的用途，因此对酪氨酸酶的研究应用受到广泛重视。本文就酪氨酸酶在有机合成、医药制备、环境保护、提取分析等方面的研究进展进行论述。

由于邻苯二酚在酶和氧存在条件下可迅速转变成邻苯醌，在波长-nm下有吸收，因此，可以通过测定邻苯二酚转变成邻苯醌的速率来表示酶活性。（酶的活性单位定义在25℃时优化的条件下(PH,离子强度等)在一分钟内转化1umol底物所需要的量）。所以实验部分是利用分光光度计测定酪氨酸酶与邻二苯酚反应生成的醌在nm波长下吸光度，利用醌的吸光度变化与时间的比值来表示酶的活性单，再利用斜率来计算原料中酶活性。这为探究酶活性的影响因素提供了依据。通过测定不同温度不同PH环境下的酶活性得出酶在30℃左右中性环境下活性最大，无机盐对酶的影响是永久失活的结论。这为以后酶的使用环境、安全储运条件提供依据。

关键词：酪氨酸酶；应用；提取；分析

Abstract

Tyrosinase,alsoknownaspolyphenoloxidaseorcatecholoxidase,hasimportantbiochemicalproperties,andawiderangeofmicroorganismsexistinplantsandanimals.Tyrosinaseiswidelyusedinchemicalfieldsinpharmaceuticalpreparation,organicsynthesis,sotheresearchandapplicationoftyrosinasehasattractedwideattention.Inthispaper,tyrosinasewillbediscussedinorganicsynthesis,pharmaceuticalpreparation,environmentalprotection,researchprogressofextractionandanalysis.

Becauseofcatecholcanbequicklyconvertedintoo-benzoquinonewiththepresenceofenzymesandoxygen,ando-benzoquinonehasabsorptionatwavelength-nm.Therefore,enzymeactivitycanbeindicatedbydeterminingtherateatwhichcatecholisconvertedtoorthoquinone(theactiveunitofanenzymedefinestheamountrequiredtoconvertthe1umolsubstrateinaminuteatanoptimumtemperatureof25℃.Sothepartoftheexperimentisusingspectrophotometricdetermineabsorbanceatnmwavelengthofo-quinonethatwasreactedtoformbyTyrosinaseandCatechol,theactivityratiooftheenzymeisexpressedbytheratioofthechangeoftheabsorbanceofquinonetothetime,andthentheslopeisusedtocalculatetheenzymeactivityintherawmaterial.Itprovidesabasisforthestudyofinfluencingfactorsofenzymeactivity.ThroughthedeterminationofenzymeactivityatdifferenttemperaturesanddifferentPHenvironment,theenzymeatabout30℃neutralenvironmentmaximumactivity,effectofinorganicsaltsonenzymeinactivationoftheconclusionispermanent.Itprovidesthebasisfortheuseofenzymesandthesafestorageandtransportationconditionsinthefuture.

Keywords：Tyrosinase;Application;Extraction;Analysis

目录

果蔬提取物中酪氨酸酶测定方法的研究

1文献综述

酪氨酸酶别名酚氧化酶、儿茶酚氧化酶或多酚氧化酶[1]。参与黑素的合成，有催化限速功效[2]。年，有人见到刚采的蘑菇为红色，放一段时间后变黑了，从那以后认识酪氨酸酶，随着科学家不断探究证明生物生长各阶段都有酪氨酸酶的出现。酪氨酸酶在各生物体内作用环境不同表达的性能也不同。科学家们开始探究酪氨酸酶是由于它能参与两个反应：能参与邻二酚反应氧化其生成醌；能羟基化单酚生成邻二酚以单酚酶的形式参与其中[3]。目前，商品化的酪氨酸酶主要是从蘑菇中提取[4]。在医药合成、环境保护、精细化工方面扮演着重要角色。

1.1酶的发展史

人类对酶的了解是通过对发酵食品和消化作用的探究慢慢演变的。很久以前古代人们就懂得将一些药料加入酒里来治病。而酒是酵母发酵的产品，是细胞酶的作用的结果。在公元10世纪左右，古书中显示人们会用豆类植物做酱。而它的制作过程是霉菌蛋白酶水解豆中蛋白质得到的。约年前，古人利用含淀粉酶的麦穗将淀粉降解为麦芽糖。年有人做实验将肉片装在金属笼子里，然后喂给老鹰，一段时间过后取出金属笼子，发现肉片被消化了。开始思考是否存在某些物质消耗掉了肉片而不是大肠蠕动的结果。这些事表明，人类在很早就已经跟酶接触，知道他的存在与作用，但是正确了解酶，科学的利用酶是在近现代时间。年，科学家们关于酵母如何发酵提出了不同的观点。以化学家利比希（Libig）为首的学派认为酵母发酵生成酒精是一种有机化学反应，而法国细菌学家巴斯德则认为发酵是由于酵母细胞活动的结果。两种说法并存了半个世纪，直到巴氏死后三年年，德国化学家彪赫纳(Buchuer)兄弟发现酵母细胞用砂磨碎后的无细胞提取液加到蔗糖溶液后也能也起发酵过程，将一份子的葡萄糖转化为2分子乙醇和2分子的二氧化碳。这才意识到无细胞结构也可发酵的事实，同时结束了这场有名的争论。这一认识很快被应用于其他细胞参与的反应中，为人类日后在细胞外的条件下应用酶生产化合物奠定了基础。在年德国的屈内（Kuhne）对于酵母中引发发酵的因素起了一个名字—enzyme。年屈内（Kuhne）首次提出“酶”的概念，此字源于希腊文由“En(在)”和“Zyme（酵母）”组合而成，表示酶存在酵母中。

20世纪以来，酶学研究发展迅速。年亨利（Henri）提出了中间产物的学说，他通过实验认定底物要与酶形成中间产物，最后生成最终产物，酶在其中没有发生变化可被从新收集。年，LeonorMichaelis和LenoraMenten根据中间产物学说推导出酶催化反应动力学的著名Michaelis-Menten方程简称米氏方程（v=Vm[S]/Km+[S]）。这一学说的提出是酶反应机理路程上的一个重大里程碑。年GeorgeE.和J.B.S.Handane对米氏方程作了修正，提出了拟稳态学说。20世纪出，沙姆那通过刀豆实验提出酶是蛋白质的观点，之后科学家们正式的证实了这一观点。之后人们开始了对酶以蛋白质的形式的研究。

随着科学的发展，对酶的认识从生物阶段到化学阶段，20世纪以来不断融合，出现了生物化学实验手段。酶工程就是典型的生物化学技术之一。酶工程涉及到的技术通常有：分离纯化；酶蛋白的化学修饰；酶的固定化；酶的修饰；酶化学交联；酶分子的定向改造。酶的生产纯化在实际应用中得到广泛的重视。随着科学急速发展纯化酶的技术也从简单的离心分离到层析技术、超离心分离、紫外分光分析、红外分析等高科技手段。使酶可以被制成单一的蛋白质，这为以后的酶学研究创下有利条件。

1.2酪氨酸酶的结构

图1.2酪氨酸酶的活性中心结构

由图可以看出，酪氨酸酶是一种铜酶，在结构上两个铜离子位于其活性中心经分析Cu-Cu的键长是0.35nm。催化反应时其位点分别以氧化态、还原态、和脱氧态三种形态参与其中。三种形态中的氧化态是指活性中心周围环境中的氧以氧化物的形肽和铜离子反应合成配位键，在中心铜离子的两个赤道面位置形成桥联配体链接着两个铜离子。还原态的结构能用O-Cu解释，还原态酪氨酸酶与氧化态不同的的是它的桥联配体是氢氧化物不是氧化物的形式，并且它们的电子构象也不同氧化态的为3d9还原态的为3d10。脱氧态酪氨酸酶指酪氨酸酶结构中两个铜的价态不同，一个是2价铜离子，另外的是1价的亚铜离子。对脱氧态酪氨酸酶的结构分析发现其活性中心的2价铜离子存在有未配对的电子，而该电子存在于dx2-y2轨道。后来研究表明脱氧态酪氨酸酶的两个价态的铜离子之间也存在着桥联配体，但是具体尚不明确。

1.3酪氨酸酶的生物学功能

酪氨酸酶在不同种类生物体内名字不同。在昆虫体内称作酚氧化酶，在植物体内称为多酚氧化酶，在微生物和人体内常称为酪氨酸酶。

大部分昆虫体内无变异情况下酪氨酸酶以酶原（无活性酶前体）的状态分布在细胞内。当受到病原微生物攻击情况下，昆虫免疫系统会经丝氨酸蛋白酶级联途径切除酚氧化酶原N-端50多个氨基酸，使其成为活化状态。活化的酚氧化酶参与机体的防御反应和伤口愈合生理过程[5]。在受伤感染情况下，血细胞发生脱粒(细胞向外释放颗粒状物质)，并与其他的血细胞集中起来，集中起来的聚集体把外来物包埋并把伤口覆盖，变为凝胶块；酚氧化酶原被血细胞分泌出，并被活化，用于催化酚类反应生醌，覆盖在伤口处，醌接着反应生成黑色素；然后，吞噬细胞来到伤口凝结处，把凝结部分和伤口内部分隔开，就这样覆盖在表面形成黑色素来减少伤口的扩张面积。昆虫的蜕皮反应中酶参与鞣化反应，鞣化激素在血细胞中把酶活化，然后酪氨酸进入表层细胞中，经酶催化形成N-乙酰多巴胺，并在上表皮细胞被氧化成醌，醌再扩散与游离氨基酸或蛋白质末端的氨基发生交联，产生不溶性的鞣化蛋白，从而使表皮硬化或暗化，并充分伸展[6，7]。昆虫中酶还参加生成硬化角质用来为无椎动物提供保护层。

图1.3.1酪氨酸酶催化酪氨酸生成黑色素

哺乳动物体内，黑素细胞内存在较多酪氨酸酶。黑素细胞产生色素的高度特异性细胞，常见于皮肤、发囊和眼睛中。酪氨酸酶催化生成的黑色素会从黑素细胞中出来并进入皮层细胞中改变皮层颜色，阻抗紫外线辐射来保护眼睛和皮肤并调控身体内温度预防温度过高。酪氨酸酶的失活或缺失通常会引起人和动物的常染色体疾病，例如白化病，当用来合成酪氨酸酶的基因出现隐性突变或从双亲遗传的是一对隐性基因，机体自身没法合成此酶，就会引起阻碍体内黑色素的形成，黑色竖不足的结果就会引起机体变白，不宜在紫外线强烈的条件下活动。酪氨酸酶活性增强时也会引起色素性疾病，例如黄褐斑。当酪氨酸酶活性增强时，黑色素的产生也会变多，但是身体细胞代谢黑色素的能力不增加或有所减弱，黑色素不能正常代谢到体外，长时间积累就会产生黄褐斑[8]。

黑素细胞通常分布在表层基层细胞间，细胞内的酪氨酶可催化酪氨酸被羟化反应形成L-3，4-二羟基丙氨酸，接着将L-3，4-二羟基丙氨酸氧化生成多巴醌。生成的醌再由2个相异的反应路程合成真黑素与褪黑素：生成真黑素是醌通过多聚化生成无色多巴色素，生成的色素很活泼会迅速与多巴醌反应生为多巴色素，多巴色素再过异构、脱羧反应为二羟基吲哚，吲哚会被酪氨酸酶催化反应为真黑素；褪黑素的合成是多巴醌和半胱氨酸(Cys)反应生成5-半胱氨酸-多巴和5-半胱氨酸-多巴醌，再经过成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成黑素（机理见图1.3.1）[6，9，10，11，12]。酪氨酸酶活性提高，合成的黑素便增多，其活性降低，合成的黑素便减少。所以说酪氨酸酶为控制黑素细胞活性的物质，并影响产生黑素的快慢。

酪氨酸酶存在生物体内位置不一样。一些真菌酪氨酸酶出现于细胞介质中，而多数真菌里的酶出现于细胞内。真菌和细菌中的酪氨酸酶是作为可溶性化合物出现并不跟细胞膜接触。植物酪氨酸酶正常情况下出现的地方有花冠、分生组织、叶片、块茎、根。正常在幼嫩部位分布较多，在成熟部味分布较少且与膜紧紧相连[13-15]。在植物细胞叶绿体中的酪氨酸酶是不活泼的是比较稳定的，但是植物酪氨酸酶可以被很多东西活化例如一些脂肪酸与胰蛋白酶。光其实也能活化酪氨酸酶。原因是没有另外化合物可活化植物酪氨酸酶的情况下，植物酪氨酸酶会由叶绿体膜上光合作用氧化活化。植物酪氨酸酶参加光合作用是以还原酶的形式调控胞质中的氧化还原水平，可同氧结合运载氧气来控制叶绿体中的光和作用速率，参与反应电子传递起到了能量转换作用[16-20]。

图1.3.2多酚氧化酶在植物细胞中合成黑色素的过程

植物酪氨酸酶参加花色的形成反应。Nakayama等人（-）在金鱼草等的提取物中探究出了金鱼草素合成酶，之后探究金鱼草素合成酶和它的cDNA显示其结构与多酚氧化酶相似性达到39%-51%，像是同一系列物质。该酶把查耳酮当做底物反应生为黄酮类化合物，由于黄酮为植物花朵变成黄色的主化合物，所以判定植物酪氨酸酶参于植物花朵颜色的形成。在衰老变褐变黑方面，暗褐色是由已存在底物与多酚氧化酶接触来引起的，黑色是由液泡膜蛋白与酶的接触引起的。植物受伤时，出现的醌类化合物是由多酚氧化酶与酚类化合物反应产生的，性质很活泼，质体的破坏导致多酚氧化酶的激活和从液泡中释放的酚类化合物相互作用，产生醌类化合物用于保护植物免受进一步伤害[15]。

1.4酪氨酸酶的应用

1.4.1酪氨酸酶在医药合成的应用

酪氨酸酶可以催化酚类物质的氧化例如催化单苯酚反应生成邻苯二酚，继而生成邻苯醌:可以作为单酚酶羟基化单酚生成邻二酚；也可作为双酚酶氧化邻二酚生成醌（机理[21]如图1.4.1）。而其催化的物理环境条件也是，现在人们的研究方向[22，23]。

酪氨酸酶可参与肽的合成：实验证实苯酰肼可以由酪氨酸酶催化下通过2步反应可以完成消除羧基保护基团的过程（机理如图1.4.2）。由于该酶拥有良佳的专一性，不会与肽键反应也不会反应掉氮端的保护基团，过程不会产生剧烈影响，这一反应原理提炼技术可广泛地应用于肽与脂、二元醇、二氧磷基团的联结。

图1.4.1酪氨酸酶催化酚类化合物机理

图1.4.2酪氨酸酶去除基酸或肽的羧基保护基团的机理

在医药领域酪氨酸酶通常用来合成L型多巴左旋多巴（合成路径如下图[24]），是用来治疗帕金森病的有效药物同时还可用于治疗腿多动综合征、肝昏迷、一氧化碳中毒、锰中毒精神病、心力衰竭溃长病、脱毛症等病状。并会调节人性功能与防老化功能。也通过体外反应制成黑色素。可以用于医药治愈因少黑色素而产生的疾病例如：着色性干皮病、帕金森氏症、老年痴呆症、亨延时舞蹈病等。据文献记载，酪氨酸酶还可体外抗HIV病毒：可干扰HIV病毒诱导的合胞体的形成阻止病毒被膜表面糖蛋白和T特异细胞与淋巴细胞的结合[25]。

图1.4.3酪氨酸酶催化酪氨酸合成L型多巴左旋多巴路径

1.4.2酪氨酸酶在保护环境中的应用

众所周知工业生活废水中纯在大量的芳香族化合物和酚类物质。酚类物质是会对生物产生毒性的，部分酚会使生物得癌症，作用在人、畜与农作物上会产生不利影响，所以解决人类生产留下的废物中的酚类毒物是世界共同正视一个问题。生活废水中的酚类毒物大都是使用煤、油、塑料等后产生的。现在把废水里的酚毒物除掉的方法有溶剂萃取法、微生物降解法、活性炭吸附法与化学氧化法。利用化学氧化法和溶剂萃取的方法可能会发生二次污染。微生物降解酚类化合物必须通过多量的培养基和大量的时间，而且由于酚的存在微生物死亡量会增多。20世纪80年代，科学家创新酶法来减少酚的不利影响，而利用酪氨酸酶解决酚毒物成为了最受欢迎的方法。酪氨酸酶把酚毒物与芳香胺类氧化反应得到醌，得到的醌再由多聚化反应生为难溶性的物体。再简单过滤就能把难溶性化合物跟水物理分离；另外的办法为通过酪氨酸酶的催化作用使酚跟丙酮酸盐还有氨反应为L一酪氨酸，L一酪氨酸为难溶性物质，再通过物理过滤把它从废水里分离去，并手机到L一酪氨酸（酪氨酸酶与废水中酚类胺类物质反应如下[26]）。

图1.4.4酪氨酸酶与废水中酚类物质反应过程

随着工业发展，同时处理的酚量增多，酚的处理也实现了工业化。科学家发现了很多固定酪氨酸酶办法，比如通过流化床固定化反应器、海藻酸铝包埋酪氨酶、磁铁固定化酪氨酸酶等方法。这些办法使得酪氨酸酶可以不断地对酚类物质进行处理，并且在储存与运输安全方面也提供了保障。

1.4.3酪氨酸酶可用于制备生物电极

生物电级是把酪氨酸酶固定在特质电极上，可以在生物传感器中使用。生物传感器能在很多杂乱体系中迅速地检测出特定物质的含量，准确率极高并不受其他物质干扰。它是把酶的专一性、灵敏性有机的融合在一起。生物传感器中酪氨酸酶的分析作用最先由Macholan和Schanel报道，他们测了还原酚类物质中的氧。此后，酪氨酸酶传感器有酚类物质的监测引起了人们极大的