转载请注明出处：-0-26
摘要
本实验首次建立一种全自动二维高效液相色谱(2D-LC-UV)检测法测定霉酚酸(MPA)，通过这种方法，在所建立的色谱条件下，霉酚酸与各杂质分离良好，在0.32～25.03μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.），可在3min内完整出峰，方法回收率高于95％；日内、日间的精密度RSD值均小于5％；稳定性试验RSD小于5％。本方法进样量大，血浆简单去蛋白后可直接进样，操作简单易行，可以满足临床大样本检测需求，适用于临床霉酚酸快速检测。
１ 材料.仪器
2D-LC-UV系统由全自动二维液相色谱耦合仪FLC（湖南德米特仪器有限公司）及岛津液相色谱LC-20AT部件构成；微型高速离心机；GH-电子分析天平；XW-80A旋涡混合器；TDZ4-WS低速离心机。
.2药品与试剂
霉酚酸；MPA-A移动相[0mmol/L乙酸水溶液（二乙胺调PH到7.5）:乙腈:异丙醇］，MPA-2A移动相［甲醇-8mmol/L（二乙胺调PH到4.7）]，ORG-2去蛋白剂，空白马血浆（以上购于湖南德米特仪器有限公司）；怡宝纯净水。 ２ 方法与结果2.色谱条件
第一维色谱系统中，色谱柱AstonSC2T(3.5ｍｍ×50mm,5μｍ)，流动相为MPA-A移动相，流速0.8mL/min。
转移柱：AstonSBR(3.0ｍｍ×0ｍｍ,5μｍ），流动相纯水。
第二维色谱系统中色谱柱：AstonSBＸ4（4.6ｍｍ×50ｍｍ，5μｍ），流动相为MPA-2A移动相，流速.2mL/min。
各色谱柱处于同一个柱温箱中，柱温：40℃，紫外检测波长：nm，采用等度洗脱，进样量μL。本实验时间程序设置见表。
2.2对照品溶液的配制
精密称取霉酚酸对照品50％异丙醇溶液溶解得母液浓度为.20μg/mL，置于-20℃冰箱中保存，备用。
2.3质控品的配制
对照品溶液用空白马血浆配制高（25.03μg/mL）、中（2.5μg/mL）、低浓度质控品（.25μg/mL）。置于-20℃冰箱备用。
2.4样品处理
EDTA抗凝管采集的血液样品低速离心（r/min）5min，精确吸取ORG-2去蛋白剂μL再加入μL血浆，涡旋振荡min后，放入高速离心机，高速离心（r/min）8min，取上清液测试。进样μL，采用外标法绘制标曲，计算得样品浓度。每次样品测定随行测一个质控品。临床检测时，随行的质控品可以每日选择不同浓度，保障3ｄ内高、中、低浓度质控品均有检测，减少误差。
2.5色谱行为和专属性
取空白血浆、中浓度质控品（2.5μg/mL）以及服药患者样本（抽取患者服药期间的静脉血，低速离心得血浆样本）处理后，进样测定，色谱图见图，图中显示样品的分离测定不受血浆内源性物质及其他杂质干扰。
A为空白血浆色谱图；Ｂ为霉酚酸对照品色谱图（2.5μg/mL），霉酚酸保留时间0.33min；Ｃ为患者服药后的血浆样品色谱图（患者服用吗替麦考酚酯分散片0.75gbidpo，给药第5日后2ｈ采集静脉血），霉酚酸保留时间0.33min。
2.6标准曲线及检测限
用空白马血浆将霉酚酸对照品溶液稀释成系列浓度溶液(0.32，0.80，2.00，5.0，2.5，3.28μg/mL)，构成标准曲线６个点，处理后进样测试，绘制标准曲线，得到线性回归方程为：Y=.7X-.22(r=0.)，定量下限质量浓度为0.32μg/mL(S/N＞0)。
图２霉酚酸标准曲线不同浓度色谱图?注：数据霉酚酸浓度3.28μg/mL?，数据2霉酚酸浓度2.5μg/mL，数据3霉酚酸浓度5.0μg/mL，数据4霉酚酸浓度2.00μg/mL，数据5霉酚酸浓度0.80μg/mL，数据6霉酚酸浓度0.32μg/mL。
2.7回收率和精密度
取高、中、低质控品，３种质控各设置６组平行，处理并测定，在同日进样，计算回收率和日内精密度，结果见表2。
再取３种质控每个浓度设置５个平行测定，取平均值，连续测定5ｄ，考察方法日间精密度，结果见表3。
由表２、表３的结果可知，本研究建立的霉酚酸分析方法的回收率高于95％，日内、日间的精密度RSD值均小于5％。该分析方法测定准确，重复性好，符合生物样品分析的要求。
2.8样品稳定性实验
取高、中、低质控品，按“2.4”项下方法处理，按“2.5”项下色谱条件，分别考察室温放置24ｈ、-20℃冰冻保存30ｄ的测试样品，结果见表４。结果表明血浆中霉酚酸稳定性良好，RSD均小于５％。
2.9临床应用
采用有限取样法估算霉酚酸体内暴露量(AUC)，采集服药前即刻，服药后,2,4ｈ共4个点血样，计算出AUC。年0-月，对我院（医院）肾移植科00名住院患者进行霉酚酸血药浓度监测，共采集个血样参考霉酚酸治疗药物监测的共识报告[2]中推荐监测霉酚酸AUC保持在30~60μg·h/ｍL，依据此推荐对监测的00例监测结果进行初步评析。22例AUC小于30μg·h/ｍL，占总样本量的22％；66例在推荐治疗窗（30~60μg·h/ｍL）之内，占总样本量的66％；2例结果高于60μg·h/ｍL，占总样本量的2％。暴露量低的结果大多属于移植早期或者服用剂量低的患者，对于这类人群临床上应予以重视，临床药师可根据TDM结果更密切地参与霉酚酸临床用药。
3讨论本研究所用液相色谱是新型全自动二维液相色谱系统，该系统样品前处理简单易行，克服普通高效液相前处理烦琐以及试剂挥发对人体的危害，具有明显优势；色谱柱通常5min可以平衡完毕，测定一个样本3min，样品间不需要冲洗。这些技术大大节省仪器准备和维护时间，增加TDM的实时性能力。
该设备我们已先后用于丙戊酸、伏立康唑、美罗培南等研究。方法学验证结果显示，在0.32~3.28μg/mL内，具有良好的线性关系（r=0.），回收率＞95％，精密度及稳定性试验均符合方法学要求。
参考文献：董馨蔚,蒋刚,马松涛,陈燕.二维液相色谱法同时测定人血浆中伊马替尼及其代谢产物浓度的方法学研究[J].肿瘤预防与治疗,,34(0):98-.点个在看你最好看
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇